H、NO2--
N、NO3--N等的過程; 好氧反硝化是指微生物在有氧氣和碳源存在的條件下, 利用氧氣和NO2--N或NO3--N作為電子受體的呼吸作用, 這與反硝化作用只能在缺氧或厭氧條件下進行這一傳統觀點不同, 也使NH4+-N在好氧條件下直接轉化為氣體即同步硝化反硝化作用成為可能（maybe).
迄今為止關于異養硝化-好氧反硝化菌的報道大多數都將重點放在菌株的最適生長條件如溫度、p
H、C/N上, 或將異養硝化作用和好氧反硝化作用分開研究; 而將二者同時研究或與缺氧反硝化相比較的報道較少.本實驗從缺氧污泥中篩選出1株具有異養硝化-好氧反硝化和厭氧反硝化功能的菌株進行鑒定, 并深入探究了其脫氮性能, 以期為異養硝化-好氧反硝化脫氮技術及其在污水生物處理工程中的應用提供理論支持.
1 材料(Material)與方法 1.1 培養基
基礎培養液：NaCl 1.0, MgCl2?6H2O 0.5, KH2PO4 0.2, KCl 0.3, CaCl2?2H2O 0.015, TES 2.292, Na2S?9H2O 0.012, N千毫安CO3 2.52.微量元素溶液1 mL, Se/W溶液1 mL, Vitamin溶液5 mL.其中微量元素溶液：HCl10 mL, FeCl2?4H2O 1.5, CoCl2?6H2O 0.19, MnCl2?4H2O 0.1, ZnCl2 0.07, H3BO3 0.006, Na2MoO4?2H2O 0.036, NiCl2?6H2O 0.024, CuCl2?2H2O 0.002; Se/W溶液: Na2SeO3?5H2O 0.006, Na2WO4?2H2O 0.008, NaOH 0.
5. Vitamin溶液：維生素H 0.02, 維生素B 0.02, 維生素B6 0.10, 維生素B2 0.05, 維生素B1 0.05, 維生素B3 0.05, 維生素B5 0.05, 對氨基苯（化學式：C6H6） 甲酸0.05, 硫辛酸0.05, 維生素B12 0.001.碳源和氮源根據實驗要求進行調整, 如表 1所示.
表 1 不同培養基中碳源、氮源投加量/mmol?L-1
菌株分離固體培養基：基礎培養液10 mL, 0.3 g?L-1 NH4Cl, 瓊脂5 g.
1.2 分析(Analyse)方法
NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N濃度采用美國DIONEX IC S-2000離子色譜儀進行定量分析, 離子交換柱為Dionex IonPac AS18-4 μm, 柱溫30℃, 流速1.0 mL?min-1; 葡萄糖濃度采用美國Agilent公司HPLC 1260 Inifinty高效液相色譜儀進行定量分析, 所用色譜柱為BIO-RAD Amenix HP 76X, RID檢測器, 柱溫80℃, 流速0.8 mL?min-1; 菌體生長用DNA濃度表示, 用美國Thermo公司Nanodrop Spectrophotometer 1000分光光度計測量.
1.3 菌株的分離和鑒定
菌株的分離：取1 mL缺氧反應器中的污泥樣品加入至裝有45 mL基礎培養液的血清瓶內, 并加入6 mmol?L-1 NaNO3和15 mmol?L-1琥珀酸鈉制成篩選培養液, 使目的菌群逐漸成為優勢菌群.當篩選培養液中NO3--N降為0時, 取5 mL菌液到新的篩選培養液中, 如此重復5個周期. 5個周期后取1 mL菌液從10-1~10-7進行梯度稀釋, 分別注入瓊脂待凝固的分離固體培養基中, 緩慢搖勻至瓊脂凝固, 約一星期后生長出若干單一菌落.用經滅菌后的注射器將單一菌落從培養基中吸出, 經數次梯度稀釋后得到純菌株.
生態學鑒定：對菌體進行革蘭氏染色, 在NIKON ECLIPSE E200顯微鏡下觀察染色結果并拍照; 以及通過Hitachi S-4300掃描電子顯微鏡拍攝照片來觀察菌株DK1的形態.
分子生物學鑒定：菌株DNA提取方法參照QIAGEN公司DNeasy Blood & Tissue試劑盒, 16S rDNA的PCR擴增采用細菌通用引物. PCR反應體系為100 μL, 即DNA模板3 μL, 10×buffer 20 μL, BSA 1.34 μL, MgCl2 12 μL, dNTP混合物2 μL, 正向引物 2 μL, 反向引物 2 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL, 無菌水57.16 μL. PCR反應條件為: 95℃預變性130 s, 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 進行30個循環, 72℃延伸6 min.將獲得的PCR產物參照QIAGEN公司PCR Purification試劑盒中的方法純化后交由1st base公司進行測序.
1.4 脫氮特性研究 1.4.1 菌株DK1在好氧條件下的脫氮特性研究
實驗在160 mL血清瓶中進行, 瓶中加入45 mL基礎培養液, 4 mL經活化后的菌液及相應濃度氮源和C/N量比為5葡萄糖.為保證瓶中空氣與外界氣體的交換, 用經高壓滅菌后的錫紙將血清瓶封口, 在32℃、140 r?min-1恒溫搖床中培養30 h, 通過每3 h測定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N及葡萄糖和DNA的濃度變化來考察菌株的脫氮能力, 每個實驗做3個平行樣品.
1.4.2 菌株DK1的缺氧(hypoxia)反硝化特性研究
實驗在60 mL血清瓶中進行, 瓶中加入36 mL基礎培養液, 3 mL經活化后的菌液及相應濃度氮源和葡萄糖.在32℃、140 r?min-1恒溫搖床中培養.為避免O2對實驗結果的影響, 基礎培養液的制備時在曝N2的條件下煮沸以去除O2并冷卻至室溫后注入充滿N2的血清瓶中, 用丁基橡膠塞和鋁蓋密封, 高壓滅菌20 min.通過測定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N及葡萄糖濃度變化來考察菌株的反硝化能力, 每個實驗做3個平行樣品.
2 結果與討論 2.1 DK1的形態（pattern)學特征及鑒定
以琥珀酸鈉為氮源的固體培養基, 菌株DK1呈白色球狀顆粒.經革蘭氏染色通過顯微鏡觀察如圖 1左所示, 鑒定其為革蘭氏陰性菌; 通過掃描電鏡如圖 1觀察到菌體為桿狀, 大小約為2 μm×0.4 μm, 無鞭毛和芽孢.
圖 1
圖 1 菌株DK1的形態特征
對菌株DK1測序獲得長度為1390bp的部分16S rRNA基因序列, 菌株的GenBank的登錄號：KY910428, 將所得的菌株序列提交至GenBank中通過BLAST檢索, 應用MEGA7軟件, 以Neighbor-Joining法繪制系統發育樹, 結果如圖 2所示, 菌株DK1與Pseudomonas sp.在同一分支, 同源性達99%.可基本確定菌株DK1屬于假單胞菌屬, 將其命名為DK1.
圖 2
圖 2 基于16S rRNA序列同源性構建菌株DK1與其他相關好氧反硝化菌的系統發育樹
2.2 菌（fungus)株DK1的好氧反硝化特性
菌株DK1在以NaNO3為氮源反硝化過程如圖 3所示.從中可看出, NO3--N的初始濃度為87.07mg?L-1, 在0~9 h下降速率較為緩慢, 從9~12 h起下降速率逐漸加快, 在15~21 h間尤為明顯, 并在21 h時降為0, NO3--N在21 h內平均去除速率達到4.09mg?-1, 遠快于文獻中菌株的反硝化速率.結合DNA變化曲線可認為菌株DK1的對數生長期為12~18 h, 并主要在這一時期以NO3--N為唯一氮源發生反硝化過程.但從15 h開始, 隨著NO3--N逐漸降低（reduce)至0, NO2--N也開始有了較為明顯的積累現象, 在21 h左右達到了最大值28.30 mg?L-1, 而后又逐漸下降, 在30 h降至15.68 mg?L-1.這與肖繼波等[13]的幾乎無NO2--N的積累現象研究結果不同.本組實驗在30 h時NO2--N并沒有完全被去除, 但DK1在以NaNO2為氮源的培養基中反硝化效果較好, 如圖 4所示, NO2--N的初始濃度為92.90mg?L-1, 經過0~9 h的生長適應期, NO2--N在9 h后迅速下降并在21 h時降為0, NO2--N去除率為100%, 平均去除速率達到4.43 mg?-1, 較連紅民等[14]研究的Pseudomonas sp. HN和Zhang等[15]研究的Bacillus methylotrophicus L7的菌速率快; 期間未檢測到NO3--N和NH4+-N.
圖 3
圖 3 菌株DK1在以NO3--N為唯一氮源的好氧反硝化特性
圖 4
圖 4 菌株DK1在以NO2--N為唯一氮源的好氧反硝化特性
從葡萄糖變化曲線可知, 兩組反硝化過程消耗葡萄糖的速率基本相等, 均約為20.02 mg?-1; 第一組菌株的21 h平均生長速率1.08 μg? -1略高于第二組的0.83 μg? -1.在30 h第一組NO2--N還未降為0的原因可能是由于葡萄糖在NO3--N還原為NO2--N時已被大量消耗, 剩余濃度較低以致菌體難以快速生長并利用NO2--N進行反硝化.為證明這一推測, 在12 d后向第一組后的血清瓶中添加6 mmol?L-1的葡萄糖, 繼續監測NO2--N濃度變化, 約經15 h后, NO2--N降為0, 假設成立.
表 2 補加葡萄糖后各組氮素濃度變化表/mg?L-1
菌株DK1以NO2--N和NO3--N為氮源的好氧反硝化特性如圖 5所示.其中NO3--N的下降與圖 3相似, 在初始濃度為85.35 mg?L-1時21 h內降解完全; 但NO2--N濃度從初始的94.95 mg?L-1在18 h前始終在上升, 在18 h時達到最大值109.21 mg?L-1后又迅速下降, 在24 h降為0.而DNA濃度在24 h前較穩定（解釋:穩固安定；沒有變動)增長, 在NO2--N和NO3--N均降為0后略有下降, 可能是缺乏氮源所致; 24 h的平均生長速率0.75 μg? -1, 略低于前兩組, 可能是由于NO2--N在前18 h的積累對菌株生長有一定的抑制作用; 葡萄糖在30 h內的平均消耗速率為46.22 mg?-1, 遠大于前兩組只加一種氮源的實驗.此外, 可知在培養基的初始底物同時含有NO2--N和NO3--N兩種氮源的條件下, 菌株DK1會優先利用NO3--N.以上實驗說明菌株DK1均可利用NO2--N和NO3--N進行代謝, 與周迎芹等[16]的實驗結果一致.
圖 5
圖 5 菌株DK1在以NO2--N和NO3--N為氮源的好氧反硝化特性
2.3 菌株DK1的異養硝化特性
為了考察菌株DK1是否具有異養硝化性能, 將活化后的菌株接種到以NH4Cl為唯一氮源的硝化培養基中進行培養, 結果如圖 6所示. NH4+-N在0~12 h內下降緩慢, 從96.14 mg?L-1只降至91.24 mg?L-1, 但12 h后去除速率明顯加快, 從12~21 h期間從91.23 mg?L-1降至約45.63 mg?L-1, NH4+-N去除率為49.98%, 21 h的平均去除速率為2.32 mg?-1, 與文獻[9][0.67 mg?-1]和文獻[17] [1.38 mg?-1]的菌屬相比較快. NH4+-N的下降與菌株的DNA濃度曲線也基本吻合, 即前12 h為生長遲緩期, 12~18 h為生長對數期, 18 h的平均生長速率為2.17 μg? -1.從21 h后, NH4+-N一直維持在48.00 mg?L-1左右不再下降, 葡萄糖也在24 h后停止下降, 平均消耗速率為25.83 mg?-1, 較單一氮源反硝化的消耗速率稍快; 推測不再下降原因仍可能（maybe)是碳源濃度較低, 菌體難以繼續生長.而12 d后再向血清瓶中添加6mmol?L-1的葡萄糖, NH4+-N在20 h后降為0, 這一現象與好氧反硝化組的結果一致.
圖 6
圖 6 菌株DK1在以NH4+-N為唯一氮源的異養硝化特性
整個實驗過程中幾乎沒有檢測(檢查并測試)到NO2--N和NO3--N.這可能是因為NH4+-N是在氨單加氧酶作用下氧化為羥胺再經羥胺氧化酶作用將其氧化直接轉化為N2O和N2等氣體并排出[18].這比較符合Richardson等[19]的異養硝化脫氮模型.造成這種現象的原因可能是菌體在長期對外界特殊環境進行調整和適應的過程中, 逐漸形成的優先選擇氮素轉化過程中最便捷的代謝方式; 還可能是由于菌株其較高的反硝化活性將硝化產生的中間產物立即利用所以檢測不到NO2--N和NO3--N的存在[20].結合2.3節中菌株DK1的兩組高效反硝化速率, 均大于本組實驗中的硝化速率, 分析后者的可能性較大. NH4+-N和碳源同時去除是異養硝化異于自養硝化最明顯的特征[21], 所以綜上, 菌株DK1可以進行異養硝化及同步硝化反硝化.
2.4 同步硝化反硝化特性
為了研究（research)在不同培養條件下同步硝化反硝化效果, 實驗采取將菌株接入含有NH4+-N和NO2--N的培養基 中、含NH4+-N和NO3--N的培養基 中以及含NH4+-
N、NO2--N和NO3--N的培養基 中觀察脫氮效果.每隔3h取樣測定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--
N、葡萄糖及DNA濃度, S1~S3組的結果見圖 7~9.
圖 7
圖 7 菌株DK1在以NH4+-N和NO2--N為氮源的同步硝化反硝化特性
圖 8
圖 8 菌株DK1在以NH4+-N和NO3--N為氮源的同步硝化反硝化特性
圖 9
圖 9 菌株DK1在以NH4+-N, NO2--N和NO3--N為氮源的同步硝化反硝化特性
在3組實驗中, S1組的NH4+-N和NO2--N及S2、S3組的NH4+-N和NO3--N在前12 h的下降速率較緩慢且相近, 但S1組在15 h后NO2--N下降速率加快, 在21h已經降為0, 平均下降速率為4.31 mg?-1; S2、S3組培養基在12 h后NO3--N下降速率加快, 在18h時即降為0, 平均下降速率為4.75 mg?-1和4.72 mg?-
1. S2、S3組的反應過程中均伴隨NO2--N積累且在15 h時達到最大值, 但隨即下降并在21 h時降為0.可以看出, 與好氧反硝化特性的實驗結果一致, 若培養基的初始底物同時含有NO2--N和NO3--N兩種氮源, 菌株DK1會優先利用NO3--N. Kim等的實驗表明當NH4+-N和NO2--N兩種氮源同時存在時, 菌株會優先選擇NO2--N進行反硝化; 而趙丹等[23]的菌株ZD8在此條件下NH4+-N的存在對NO2--N的反硝化有抑制, 菌株會利用NH4+-N先發生硝化作用.本實驗結果與此二者均不同, 菌株DK1可同時將二者降解; 張培玉等[24]的實驗表明NO2--N的加入不但沒有抑制異養硝化作用, 反而加速了NH4+-N的降解, 而本實驗結果于此也不同, NO2--N的加入對異養硝化作用幾乎無影響, NH4+-N的降解速率與不加NO2--N時幾乎相等.
而S1、S2組的NH4+-N下降速率在12 h后雖然較前有所加快, 但始終低于該組中NO2--N或NO3--N的下降速率, 且在27 h后停止下降, 前27 h的平均下降速率為3.04 mg?-1和3.12mg?-1, 遠高于He等[25]研究的菌; 而S3組的NH4+-N在30 h時降為0, 30 h的平均下降速率為3.18mg?-1.
S1、S2組前30 h和S3組前27 h的葡萄糖消耗速率與DNA生長速率趨勢基本相符; S3組的DNA濃度在27 h后開始下降, 可能原因是氮源已基本耗盡.同異養硝化和好氧反硝化兩部分實驗的方法, 12 d后再向血清瓶中添加葡萄糖, NH4+-N在11 h后也降為0.比較S1、S2兩組培養基的脫氮效果, NO2--
N、NO3--N去除率均達100%, NH4+-N去除率也相近, 分別為90.30%和89.65%, 可知這兩組系統脫氮效果基本相同.在C/N量比為5的條件下, S3組系統的脫氮效率最高, 30 h內3種氮源均達到了100%, 高于王驍靜等[26]的研究結果.
2.5 菌株DK1的缺氧反硝化特性
由圖 10可知, 與好氧反硝化相似, 菌株DK1在缺氧條件下初始NO3--N濃度為83.75 mg?L-1時也在21 h左右將NO3--N降為0, NO3--N的平均去除速率為3.99 mg?-1, 但在21 h時NO2--N也為0, 脫氮率達100%, 高于好氧條件.由圖 11可知在以NO2--N和NO3--N為氮源的缺氧反硝化實驗中, 菌株DK1仍優先利用NO3--N進行反硝化并且伴有NO2--N積累現象, 且NO3--N平均去除速率與好氧基本相同, 為4.01 mg?-
1. NO2--N在21 h降為0, 去除速率相比好氧組的24 h仍較高.
圖 10
圖 10 菌株DK1在以NO3--N為唯一氮源的缺氧(hypoxia)反硝化特性
圖 11
圖 11 菌株DK1在以NO2--N和NO3--N為氮源的缺氧反硝化特性
但是此缺氧條件下的兩組DNA濃度均低于好氧條件, 所以, 從這兩組含有NO3--N的缺氧反硝化實驗可以推測, O2的存在對于NO3--N反硝化到NO2--N的速率并無太大影響, 但對于NO2--N的反硝化速率和碳源的利用有一定的抑制作用.
2.6 菌株DK1在不同NO2--N濃度下的缺氧反硝化特性
根據DK1在NO3--
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