1 分子生物學(xué)技術(shù)
表 1列舉了常用于研究水處理微生物種群結(jié)構(gòu)的主要分子生物技術(shù)、初期重要技術(shù)文獻(xiàn)及該種技術(shù)的特點(diǎn)。
表 1 微生物種群結(jié)構(gòu)研究采用的主要分子生物技術(shù)
研究內(nèi)容
代表技術(shù)
初期重要技術(shù)文獻(xiàn)
基本原理
備注
多樣性分析
DGGE/TGGE
1993 年 G.Muyzer 等初次應(yīng)用 DGGE 技術(shù)分析(Analyse)復(fù)雜的微生物種群結(jié)構(gòu)
對 16SrRNA 進(jìn)行擴(kuò)增袁通過 DGGE/TGGE 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析
應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一 , 重現(xiàn)性與靈敏度差
SSCP
1996 年 D.H.Lee 等首次采用 PCR-SSCP 技術(shù)分析自然生態(tài)系統(tǒng)的微生物菌群結(jié)構(gòu)
利用 DNA 單鏈構(gòu)象的多態(tài)性袁根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率的不同來分析(Analyse) DNA 單鏈中的基因突變
在突變檢測上應(yīng)用較多 , 微生物群落結(jié)構(gòu)解析研究較少
RISA
1996 年 V.G 俟 rtler 等采用 16S-23SrDNA 間隔片段區(qū)分和識別細(xì)菌
以細(xì)菌 16S 和 23SrDNA 間隔片段 為研究對象袁 ITS 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳分離可以獲得特異性的長度多態(tài)性圖譜
ITS 長度的特異性理論上可以表現(xiàn)出較大的多樣性
ARDRA
1992 年 M.Vaneechoutte 等初次建立了 ARDRA 分析方法
選擇性擴(kuò)增 rDNA 片段袁再對 rDNA 進(jìn)行限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(Analyse)。
快速有效袁用 OTUs 多樣性估計最低限度細(xì)菌（fungus)種的數(shù)目
T-RFLP
1994 年 C.L.Moyer 等采用 RFLP 研究深海活火山口微生物多樣性 ;1997 年 W.T.Liu 等首先將 T-RFLP 技術(shù)用于微生物群落分析
綜合 PCR 技術(shù)堯 DNA 限制性酶切技術(shù)堯熒光標(biāo)記技術(shù)和 DNA 序列自動分析技術(shù)袁對特定核酸片段長度多態(tài)性進(jìn)行測定
主要應(yīng)用于微生物群落組成和結(jié)構(gòu)堯微生物系統(tǒng)發(fā)育及菌種鑒定研究
菌種鑒定
FISH
1989 年袁 E.F.DeLong 等用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針來探測獨(dú)立的微生物細(xì)胞
將待測微生物核酸分子變性后袁利用熒光標(biāo)記的探針袁與細(xì)胞內(nèi)堿基互補(bǔ)配對袁在一定激發(fā)波長下用顯微手段測定微生物的分布與數(shù)量
應(yīng)用最為廣泛(extensive)的技術(shù)之一 , 雜交和洗滌步驟的條件優(yōu)化十分困難
16SrRNA 克隆文庫技術(shù)
1990 年 S.J.Giovannoni 等初次采用針對 16SrRNA 基因的克隆文庫技術(shù)對 SargassoSea 微生物進(jìn)行分析
將微生物細(xì)胞 16SrRNA 特異擴(kuò)增后 , 對核苷酸序列測定袁測定結(jié)果與已知序列比較袁鑒定微生物種屬
應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一 , 準(zhǔn)確度高 . 需專業(yè)人員和設(shè)備 , 不適合高通量分析
基因芯片(又稱微電路)技術(shù)
1991 年 S.P.Fodor 等初次提出生物芯片淵 Biochip 冤概念 ;1995 年 M.Schena 等用 DNA 微陣列技術(shù)并行檢測擬南芥多個基因的表達(dá)水平
綜合原位雜交技術(shù)堯微電子技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)和計算機(jī)技術(shù) , 對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行分析
設(shè)備復(fù)雜袁但可集成打包處理
定量分析
實(shí)時定量 PCR
1996 年 C.A.Heid 等初次研發(fā)了一種實(shí)時定量 PCR 方法 , 相比于定量 PCR 操作更加簡便精確
在 PCR 反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)袁通過檢測熒光信號的變化來監(jiān)測 PCR 擴(kuò)增過程
核酸檢測和定量的精確方法
注： DGGE/TGGE 為變性 / 溫度梯度凝膠電泳； SSCP 為單鏈構(gòu)象多態(tài)性； RISA 為核糖體基因間隙分析(Analyse)； ARDRA 為擴(kuò)增性 rDNA 限制性酶切片段分析； T-RFLP 為末端限制酶切片段長度多態(tài)性分析； FISH 為熒光標(biāo)記原位雜交。膜生物反應(yīng)器膜分離技術(shù)與生物處理技術(shù)有機(jī)結(jié)合之新型態(tài)廢水處理系統(tǒng)。以膜組件取代傳統(tǒng)生物處理技術(shù)末端二沉池，在生物反應(yīng)器中保持高活性污泥濃度，提高生物處理有機(jī)負(fù)荷，從而減少污水處理設(shè)施占地面積，并通過保持低污泥負(fù)荷減少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池內(nèi)之膜分離設(shè)備截留槽內(nèi)的活性污泥與大分子有機(jī)物。膜生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)活性污泥（MLSS）濃度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥齡(SRT)可延長至30天以上。
2 分子生物學(xué)技術(shù)在污水處理中的應(yīng)用
2.1 不同種類污水在同一處理工藝中的微生物種群比較
污水種類是決定活性污泥種群結(jié)構(gòu)的重要因素。張斌等采用DGGE技術(shù)對處理浴池游泳館污水、學(xué)生公寓污水、醫(yī)院污水和人工配水4種污水的膜生物反應(yīng)器污泥種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，比較了總細(xì)菌和氨氧化（oxidation)細(xì)菌，并對優(yōu)勢菌進(jìn)行了16S rDNA克隆測序。結(jié)果表明，4個MBR中既存在共有的微生物種屬，但優(yōu)勢地位并不相同，又存在各自獨(dú)特的種屬，同源性分析顯示優(yōu)勢種群以Proteobacteria綱和Bacillus屬為主，對氨氮降解起主要作用的細(xì)菌群落屬于相同的種屬，且都處于頂級地位；反應(yīng)器中存在著多種氨氧化菌屬，其中以亞硝化單胞菌屬最為普遍，并且鑒定出2種反硝化菌屬，菌落中含有的亞硝化菌屬表明生物處理過程中含有多種硝化和脫氮途徑。N. Boon等使用16S rRNA作引物結(jié)合DGGE 技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)方法分析生活污水、造紙廠廢水、食品廠廢水以及紡織廠工業(yè)廢水的活性污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果表明，DGGE和16S rRNA技術(shù)不僅可用于比較微生物群落間的差異，同時也可作為一種工具以改善污水處理過程中的監(jiān)測和控制，改進(jìn)處理不同種類廢水的活性污泥工藝。
2.2 不同生物處理工藝中的微生物種群研究
2.2.1 活性污泥工藝
活性污泥工藝是污水處理中最常見的工藝，應(yīng)用廣泛。Xinchun Liu等使用DGGE技術(shù)對兩個分別采用缺氧/厭氧/好氧工藝和A/O工藝的水處理廠進(jìn)行研究，結(jié)果表明兩個生物處理系統(tǒng)具有相似的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，原水中的優(yōu)勢（解釋:能壓倒對方的有利形勢)菌落并不是活性污泥的優(yōu)勢菌落，處理效果好的系統(tǒng)與效果較差系統(tǒng)中的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)類似。王曉慧等采用基于16S rRNA基因的T-RFLP技術(shù)分析處理相同原水的
A、B兩套污水處理系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)，其中A為A2/O工藝，B為倒置A2/O工藝。結(jié)果表明，出水穩(wěn)定的兩套污水處理系統(tǒng)中特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛的群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著變化，該結(jié)論與A. Briones等對工程環(huán)境下微生物種群結(jié)構(gòu)的過程穩(wěn)定性研究所得結(jié)論相對應(yīng)，即生態(tài)系統(tǒng)中存在多種功能相近的菌種，在環(huán)境條件發(fā)生變化的情況下弱勢菌種會轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌種并形成新的平衡，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。
2.2.2 生物膜工藝
生物膜法是利用微生物附著生長在填料或載體表面，形成膜狀的活性污泥。肖勇等為了研究處理垃圾滲濾液的序批式生物膜反應(yīng)器中的特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛多樣性，采用DGGE技術(shù)進(jìn)行分析，對凝膠染色并進(jìn)行條帶統(tǒng)計分析、切膠測序、同源性分析同時建立了系統(tǒng)樹。結(jié)果表明，該SBBR中有多種硝化細(xì)菌與反硝化細(xì)菌、好氧(Oxygen)反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌共存，反應(yīng)器中可能同時存在全程硝化反硝化、同步硝化反硝化和厭氧氨氧化3種脫氮方式。
2.2.3 膜生物工藝
膜生物反應(yīng)器是現(xiàn)代膜分離技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)生物處理技術(shù)產(chǎn)生的一種高效水處理工藝。牟潔等使用PCR-DGGE技術(shù)考察了天津某再生水處理廠MBR的培養(yǎng)馴化直至正常運(yùn)行全過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替情況，結(jié)果表明在整個污泥馴化過程中，微生物群落遭受了沖擊，最終趨于穩(wěn)定，并形成了新的特有的微生物群落生態(tài)系統(tǒng)，證明其中的優(yōu)勢菌種在去除有機(jī)物過程中起到關(guān)鍵作用。A. C. Cole等對好氧膜生物反應(yīng)器與活性污泥工藝進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明MABR比常規(guī)活性污泥系統(tǒng)有更豐富的微生物種群，且對于去除廢水中的含氮、含碳有機(jī)物有巨大潛能。
2.2.4 其他類型生物處理工藝
Shuo Feng等將amoA基因的T-RFLP分析與克隆和序列分析相結(jié)合，研究中試規(guī)模的顆粒活性炭-砂子雙重過濾器中氨氧化古細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌混合菌群的空間異質(zhì)性。中空纖維膜紡絲機(jī)外形像纖維狀，具有自支撐作用的膜。它是非對稱膜的一種，其致密層可位于纖維的外表面／如反滲透膜，也可位于纖維的內(nèi)表面(如微濾膜和超濾膜)。對氣體分離膜來說，致密層位于內(nèi)表面或外表面均可。結(jié)果表明顆粒活性炭樣品上的氨氧化細(xì)菌菌群隨樣品在過濾器中深度的變動而變化。而且，亞硝化單胞菌及其類微生物是顆粒活性炭樣品中的優(yōu)勢氨氧化細(xì)菌菌種。 Xiaolei Liu等對處理中國傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)廢水的厭氧折流反應(yīng)器中4個不同隔斷的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，研究分3個階段：DGGE結(jié)果顯示正常負(fù)荷條件下，在有機(jī)負(fù)荷增高階段，4個隔斷中同一取樣時間的微生物樣本種群結(jié)構(gòu)并不相同，同一隔斷中不同取樣時間的微生物樣本種群結(jié)構(gòu)也不相同；在OLR穩(wěn)定階段，隔斷中的微生物種群結(jié)構(gòu)趨于相似；在OLR超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)階段，隔斷中的微生物種群結(jié)構(gòu)變化應(yīng)對水質(zhì)變化的機(jī)能被破壞，出水水質(zhì)迅速惡化，微生物種群結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定段相比變化顯著。
王峰等對比研究了城市污水化學(xué)生物絮凝強(qiáng)化一級處理工藝與傳統(tǒng)完全混合式處理工藝反應(yīng)池的活性污泥樣品微生物種群結(jié)構(gòu)，證明化學(xué)生物絮凝處理工藝的微生物作用機(jī)理與成分相近的完全混合式處理工藝中微生物的作用機(jī)理可能存在相當(dāng)大的差別。
2.3 菌株的鑒定(同義詞:判定、判斷、判決)及在生物強(qiáng)化技術(shù)中的應(yīng)用
分子生物技術(shù)可從微觀角度更細(xì)致地了解污染物的降解機(jī)制。膜生物反應(yīng)器在污水處理，水資源再利用領(lǐng)域，MBR又稱膜生物反應(yīng)器（Membrane Bio-Reactor ）,是一種由膜分離單元與生物處理單元相結(jié)合的新型水處理技術(shù)。FISH技術(shù)是活性污泥菌株鑒定中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，該技術(shù)結(jié)合顯微鏡的可視性，通過(tōng guò)激發(fā)雜交探針的熒光來檢測(檢查并測試)信號，從而對未知的核酸序列進(jìn)行檢測，結(jié)果可直接在熒光顯微鏡下觀察。S. Hallin等采用FISH和DGGE技術(shù)分析活性污泥處理系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌的群落組成，并用Quantitative-FISH定量分析，研究發(fā)現(xiàn)FISH 法可確定AOB中與種群數(shù)量相關(guān)的Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha兩種優(yōu)勢菌群，而DGGE法只能檢測到后者。16S rDNA克隆測序技術(shù)是另一種廣泛使用的菌株鑒定技術(shù)，Shunni Zhu等成功從活性污泥中分離出一種喹啉降解菌株，通過16S rDNA測序繪制系統(tǒng)樹，解析出其具體菌屬，并通過實(shí)驗進(jìn)一步驗證其降解喹啉的性能。
利用分子生物技術(shù)篩選有價值的功能微生物并加以培養(yǎng)利用可有效提高污水處理效果。邢林林等采用RISA技術(shù)解析了一個處理溴氨酸廢水的生物反應(yīng)器在投加高效菌前后的污泥系統(tǒng)群落變化，分析(Analyse)表明高效菌可以在系統(tǒng)中穩(wěn)定存在，且不對原菌群結(jié)構(gòu)造成較大影響。Fang Ma等采用生物強(qiáng)化方法升級一個煉油廢水生物處理系統(tǒng)，通過PCR-TGGE技術(shù)對系統(tǒng)內(nèi)的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌的種群數(shù)和種類在各個階段不盡相同，生物強(qiáng)化后長鏈烷烴濃度急劇下降，去除率達(dá)70%以上，幾乎所有的苯（化學(xué)式：C6H6） 和苯系物、酯類以及醛酮類都被降解。生物強(qiáng)化后難降解有機(jī)物減少到32種，相比于未生物強(qiáng)化減少了50%。 具體參見
3 結(jié)語
與傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)相比，分子生物學(xué)技術(shù)為研究（research)水處理領(lǐng)域的微生物種群結(jié)構(gòu)開辟了一條全新的思路，通過(tōng guò)檢測污水生物處理系統(tǒng)中的微生物種群核酸序列多態(tài)性、鑒定個體的基因型，可以了解系統(tǒng)中微生物群體的多樣性、實(shí)際生存狀態(tài)和功能特點(diǎn)，可在分子水平上闡述廢水生物處理的機(jī)制，對于更好地優(yōu)化污水處理系統(tǒng)具有理論意義與應(yīng)用價值。
