高效、穩(wěn)定的亞硝化反應(yīng)是運(yùn)行SHARO
N、ANAMMO
X、CANON等新型生物脫氮工藝的先決條件.本課題組的前期研究表明，培養(yǎng)具有亞硝化功能的完全自養(yǎng)型好氧顆粒污泥，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)氨氧化菌的高度富集，以突破當(dāng)前限制“亞硝化路線”的技術(shù)瓶頸.
作為實(shí)現(xiàn)污泥顆粒化的關(guān)鍵步驟（procedure)，胞外聚合物的累積不僅是微生物適應(yīng)外界環(huán)境變化、保障(起保障作用的事物)自身聚集生長(zhǎng)的必要條件，也是影響污泥形態(tài)結(jié)構(gòu)與降解活性的重要因素.因此，建立環(huán)境因素、污泥性狀與EPS組成的相互關(guān)系，對(duì)完善、優(yōu)化現(xiàn)有污水生物處理理論與技術(shù)具有重大意義.值得注意的是，EPS的化學(xué)組成與提取方法、污泥種類密切相關(guān).目前，國內(nèi)外鮮有關(guān)于亞硝化顆粒污泥EPS組成特性的報(bào)道.因此，有必要選出合適的提取方法并對(duì)其EPS組成進(jìn)行分析.
本研究以異養(yǎng)型好氧顆粒污泥、普通活性污泥和厭氧顆粒污泥為參照，分別考察離心法、加熱法、熱堿法、甲醛-NaOH法和甲醛-熱堿法對(duì)亞硝化顆粒污泥中EPS組分的提取效果，以選出最佳方法，并利用蛋白質(zhì)/多糖含量測(cè)定、三維熒光與傅里葉紅外光譜等表征手段，比較分析GNS有別于其他污泥樣品的EPS組成特性，以期為探究完全自養(yǎng)型好氧顆粒污泥的形成機(jī)理與形態(tài)特征提供參考.
2 材料與方法
2.1 污泥樣品
本研究所選污泥樣品的種類、來源與性質(zhì)如表 1所示.其中，AS是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)GNS和AGS的接種污泥.
表 1 4類污泥樣品的來源與性質(zhì)
2.2 EPS的提取方法
2.2.1 樣品預(yù)處理
采用離心預(yù)處理去除污泥樣品液中的可溶性有機(jī)物.取20 mL污泥液，在4 ℃、10000 r?min-1條件下離心10 min，棄去上清液，并使固體重新懸浮于中性磷酸緩沖溶液中，重復(fù)上述操作控制1次，所得樣品待用.隨后，對(duì)所有顆粒污泥均進(jìn)行了超聲處理，即在冰水浴、功率35 W條件下，超聲4 min.
2.2.2 EPHOTOSHOP的提取方法與流程
為保證研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的可比性，本文選擇了5種常用的EPHOTOSHOP提取方法，并建立對(duì)照法，具體操作控制過程如圖 1所示.
圖 1 EPS提取方法的流程
2.3 EPS的組分分析
在本研究中，EPS總量是指PN與PS質(zhì)量濃度之和，單位為 mg?g-1.蛋白質(zhì)含量采用Lowry法測(cè)定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì).多糖濃度采用苯酚-硫酸法測(cè)定，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì).P
N、PS的測(cè)定結(jié)果取3次平均值.污泥濃度采用標(biāo)準(zhǔn)重量法測(cè)定.EPS提取液中的總有機(jī)碳采用耶拿元素分析儀測(cè)定，并作為表征污泥EPS總量的輔助性指標(biāo).
三維熒光光譜測(cè)定步驟（procedure)：以Milli-Q純水為空白，使用1 cm熒光池在Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)的同步掃描模式下進(jìn)行分析.光電倍增管電壓為500 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為200~400 nm和200~600 nm，掃描間隔均為10 nm，掃描速度1200 nm?min-1，峰強(qiáng)度最大量程為1000 A.U.采用Origin 8.5繪制等高線圖.
傅里葉紅外光譜測(cè)定步驟：將EPS提取液置于冷凍干燥機(jī)中24 h，對(duì)固體進(jìn)行仔細(xì)研磨，并按1 ∶ 100的質(zhì)量比與高純度KBr混合后壓片，使用Thermo傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行分析.
3 結(jié)果
3.1 亞硝化顆粒污泥EPS的提取結(jié)果
如表 2所示，對(duì)于亞硝化顆粒污泥而言，各提取方法所獲得的EPS總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對(duì)照法.對(duì)參照污泥的提取結(jié)果也大體如此.
表 2 采用不同方法對(duì)4類污泥樣品EPS的提取結(jié)果
作為顆粒污泥中重要的結(jié)構(gòu)性組分，蛋白質(zhì)和多糖通常可以占到污泥EPS總量的70%以上.由圖 2可知，無論采用何種提取方法，亞硝化顆粒污泥EPS中PN/PS比值始終大于1.其中，離心法是一種較為溫和的提取方法，其結(jié)果僅代表松散結(jié)合的胞外聚合物含量，后者對(duì)污泥的絮凝、脫水性能有直接影響.相比之下，經(jīng)熱堿法處理后，污泥有明顯的破胞現(xiàn)象，提取液呈棕黃色，TOC濃度很高，大量蛋白質(zhì)的溶出導(dǎo)致PN/PS比值高達(dá)8.4.參照污泥的EPS提取過程也存在類似現(xiàn)象，這與張麗麗等對(duì)好氧顆粒污泥EPS提取方法的研究結(jié)果一致.同樣使PN/PS比值偏高的還有加熱法，具體表現(xiàn)為對(duì)多糖的提取效果較差.如果預(yù)先投加適量甲醛(aldehyde)，起到固定與緩沖作用，將有效降低高溫、強(qiáng)堿對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使水相中DNA等胞內(nèi)物質(zhì)含量與胞漿酶活性均處于較低水平.在本研究中，甲醛-NaOH法對(duì)污泥EPS的提取量?jī)H次于熱堿法，且PN/PS比值與對(duì)照組結(jié)果接近.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲醛-NaOH法提取的DNA濃度在0.1~3.3 mg?g-1，遠(yuǎn)小于熱堿法和加熱法的對(duì)應(yīng)值，但高于離心法的0.05~0.5 mg?g-1.本研究提出的甲醛-熱堿法對(duì)亞硝化顆粒污泥EPS的提取結(jié)果與甲醛-NaOH法相當(dāng)，提取時(shí)間縮短了近60%，但甲醛-熱堿法對(duì)參照污泥中蛋白質(zhì)的提取效果并不理想.
圖 2 4類污泥樣品EPHOTOSHOP中蛋白質(zhì)與多糖的含量
由表 2可知，當(dāng)采用相同的提取方法時(shí)，4類污泥的EPHOTOSHOP含量大體遵循：AGS>AS>AnGS>GNS.出于維持特殊結(jié)構(gòu)的需要，好氧顆粒污泥的EPS以緊密結(jié)合的胞外聚合物為主，其總量遠(yuǎn)高于活性污泥的水平.其次，當(dāng)污泥從好氧轉(zhuǎn)至厭氧環(huán)境中，部分EPS將以碳源、能源的形式被消耗掉，因而，厭氧顆粒污泥的EPS總量不高，并含有較多的腐殖酸類物質(zhì).相比之下，比生長(zhǎng)速率僅為0.32~0.76 d-1的AOB等自養(yǎng)菌常被認(rèn)為不能產(chǎn)生充足的EPS，以保障其獨(dú)立完成顆粒化過程.即使在穩(wěn)定運(yùn)行100 d以上的完全自養(yǎng)硝化顆粒污泥中，異養(yǎng)菌仍具有一定的活性，并對(duì)維持污泥結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到積極作用.最近，戴昕利用PCR-DGG
E、454高通量測(cè)序和qPCR等分子生物學(xué)手段證明，AGS形成過程中定向分泌的胞外蛋白質(zhì)主要來自高度富集的Zoogloea spp.菌株.而Wu等的研究也表明，將反應(yīng)器進(jìn)水COD/NH4+-N控制在1~2之間，20 d內(nèi)即可獲得成熟的硝化顆粒污泥，高比例的多糖成分對(duì)于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、附著能力較差的硝化細(xì)菌起到了很好的固定(fixed)作用.本研究發(fā)現(xiàn)，亞硝化顆粒污泥的EPS組成也具有類似特點(diǎn).當(dāng)采用甲醛-NaOH法進(jìn)行提取時(shí)，GNS的PS/PN比例為0.77，遠(yuǎn)高于其他污泥樣品.
3.2 亞硝化顆粒污泥EPHOTOSHOP的三維熒光分析
在統(tǒng)一采用甲醛-NaOH法的前提下，對(duì)4類污泥樣品的EPS進(jìn)行三維熒光光譜分析，結(jié)果如圖 3所示.依據(jù)Chen等總結(jié)的3D-EEMs圖譜分析方法，可以獲得熒光特征峰的相關(guān)參數(shù)，具體見表 3.從圖譜形狀與特征峰位置來看，亞硝化顆粒污泥與異養(yǎng)型好氧顆粒污泥的結(jié)果非常接近，強(qiáng)熒光峰均主要來自可溶性微生物代謝產(chǎn)物和芳香類蛋白質(zhì)，這也體現(xiàn)了兩者在顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)上的相似性.盡管普通活性污泥的EPS也含有同類型的熒光峰，但峰強(qiáng)要低得多，這意味著顆粒污泥具有比絮狀污泥更高的微生物活性和更多的結(jié)構(gòu)性蛋白的研究結(jié)果表明，顆粒污泥較絮狀污泥含有更豐富的酪氨酸、色氨酸等芳香 類蛋白，該類物質(zhì)有利于促進(jìn)細(xì)胞聚集和增強(qiáng)顆粒的穩(wěn)定性.另外，本研究選取的好氧顆粒污泥是以簡(jiǎn)單化合物為碳(C)源和氮源.因此，好氧顆粒污泥EPS的3D-EEMs圖譜中并未找到厭氧顆粒污泥中常見的類腐殖酸峰.Zhu等發(fā)現(xiàn)，在污泥顆粒化過程中，類腐殖酸峰的強(qiáng)度呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)（trend)，并認(rèn)為除了進(jìn)水水質(zhì)的影響以外，顆粒污泥EPS中腐殖酸的含量與其成熟度存在一定的關(guān)聯(lián)性.
圖 3 4類污泥樣品EPHOTOSHOP的三維熒光圖譜
表 3 污泥樣品EPS的熒光特性分析(Analyse)
3.3 亞硝化顆粒污泥EPS的傅里葉紅外分析
在相同前提下，對(duì)4類污泥樣品的EPS進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果如圖 4所示.波長(zhǎng)在1000 cm-1以內(nèi)的指紋區(qū)特征峰大多由含硫、磷的不飽和鍵發(fā)出，而蛋白質(zhì)、多糖等EPS組分主要集中于1000~1800 cm-1區(qū)間.其中，1070、1296 cm-1附近的特征峰分別由多個(gè)C―O不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和O―H變形振動(dòng)引起，均明確指向多糖組分.1454、1610和3430 cm-1則對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)中常見的C―O
H、H―N―H和N―H等酰胺類基團(tuán)，1667 cm-1更是與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Amide III密切相關(guān).
圖 4 4類污泥樣品EPS的傅里葉紅外光譜圖
與3D-EEMs的結(jié)果類似，亞硝化顆粒污泥EPHOTOSHOP的紅外特征峰位置與異養(yǎng)好氧顆粒污泥基本一致，但前者的峰強(qiáng)更高.相比之下，普通活性污泥與厭氧顆粒污泥的峰型更為雜亂.這說明污泥顆粒化過程(guò chéng)在對(duì)微生物種類進(jìn)行選擇性“淘洗”的同時(shí)，也簡(jiǎn)化了胞外聚合物的組成.對(duì)于AnGS而言，EPS中的腐殖酸會(huì)在一定程度上干擾PN與PS對(duì)應(yīng)特征峰的定位.具體參見污水寶商城資料或
4 結(jié)論
1)不同方法對(duì)亞硝化顆粒污泥EPS的提取總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對(duì)照法.其中，甲醛-NaOH法能在有效保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)，獲得較高的EPS提取效率，濃度值為mg?g-1.耗時(shí)更短的甲醛-熱堿法對(duì)亞硝化顆粒污泥同樣適用，但其對(duì)參照污泥的提取結(jié)果并不理想.
2)在本研究中，亞硝化顆粒污泥的EPS總量最低，這可能與自養(yǎng)菌分泌EPS的能力較弱有關(guān).但在GNS的EPS組分中，PS/PN比值為0.77，遠(yuǎn)高于以異養(yǎng)微生物為主的其他污泥樣品，豐富的多糖成分對(duì)于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、附著能力較差的氨（化學(xué)式：NH3） 氧(Oxygen)化菌能起到較好的固定作用.
3)由3D-EEMs和FT-IR圖譜可知，亞硝化顆粒污泥EPS的熒光特征與異養(yǎng)型好氧顆粒污泥非常類似，特征峰均主要來自可溶性微生物代謝產(chǎn)物和芳香類蛋白質(zhì).與普通活性污泥相比，亞硝化顆粒污泥具有更高的微生物活性和更豐富的結(jié)構(gòu)性蛋白，且EPS組成也更為簡(jiǎn)單.
