活性污泥法是最重要的污水處理工藝之一，在世界范圍內(nèi)已被廣泛地應(yīng)用于處理市政污水和工業(yè)廢水，其工藝流程通常是將厭氧(Oxygen)、缺氧和好氧環(huán)境結(jié)合起來(lái)實(shí)現(xiàn)除碳磷和脫氮的功能.活性污泥系統(tǒng)是一個(gè)功能強(qiáng)大的微生態(tài)系統(tǒng)，其中，最主要的自養(yǎng)菌是硝化細(xì)菌，即氨氧化細(xì)菌與亞硝酸鹽氧化菌.為了實(shí)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的硝化效果，污水處理廠通常將曝氣池中的溶合氧濃度控制在2 mg?L-1以上.但在較低的DO濃度下，完全混合式或者生物膜反應(yīng)系統(tǒng)中也能實(shí)現(xiàn)完全的硝化作用.如果污水處理廠能在低DO環(huán)境下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定達(dá)標(biāo)，那么將大大降低污水廠的運(yùn)行能耗.本研究通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)期運(yùn)行的缺氧/好氧推流式活性污泥小試試驗(yàn)系統(tǒng)，考察系統(tǒng)的脫氮效果和系統(tǒng)內(nèi)硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨DO濃度變化的規(guī)律，探討低DO生物脫氮的可能性，以期為實(shí)際污水廠在低DO濃度下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的硝化效果，節(jié)約能耗提供可靠的理論依據(jù).
2 材料與方法
2.1 材料
接種污泥取自北京北小河污水處理廠;進(jìn)水為人工配水，COD為300~400 mg?L-1，NH4+-N濃度為45~55 mg?L-1，pH控制（control)在7.5~8.5.
2.2 反應(yīng)器裝置和運(yùn)行條件
采用缺氧(hypoxia)/好氧推流式活性污泥工藝，缺氧和好氧池總體積為37.5 L，缺氧池/好氧池的體積比為
1:4，水力停留時(shí)間為9 h;沉淀池體積為24 L，停留時(shí)間為3 h.進(jìn)水流量為96 L?d-1，混合液回流比R=200%，污泥回流比r=150%.實(shí)驗(yàn)裝置如圖 1所示.
圖 1 反應(yīng)器裝置示意圖
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溫度維持在20~25 ℃，SRT為20 d，反應(yīng)器初始污泥濃度在3000 mg?L-1左右.以DO為3 mg?L-1啟動(dòng)反應(yīng)器，待系統(tǒng)穩(wěn)定后將DO逐漸降低到2、1、0.5、0.3和0.2 mg?L-1運(yùn)行，在本研究中，3和2 mg?L-1屬于高DO濃度工況，而1、0.5、0.3和0.2 mg?L-1屬于低DOI濃度工況.
2.3 水質(zhì)和污泥性質(zhì)測(cè)定
系統(tǒng)(system)運(yùn)行期間每隔2~4 d取水樣測(cè)定進(jìn)出水水質(zhì)，采用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)項(xiàng)目包括CO
D、NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N和TN.在每個(gè)工況的運(yùn)行后期采集活性污泥樣品，置于-80 ℃保存. MLSS和SVI分別采用馬弗爐燃燒減重法和30 min沉降法測(cè)定.
2.4 硝化細(xì)菌（fungus)群落結(jié)構(gòu)分析
2.4.1 DNA的提取
用改進(jìn)的Zhou法提取活性污泥的DNA，即玻璃珠振蕩-SDS-氯仿異戊醇法.
2.4.2 硝化細(xì)菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增
AOB的擴(kuò)增：采用其功能基因amoA的引物對(duì)amoA-1F和amoA-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 60 s，51 ℃退火 90 s，72 ℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min，冷卻至4 ℃保存.
NOB的擴(kuò)增：對(duì)于Nitrobacter，選用F1370 F1和F2843 R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸5 min，冷卻至4 ℃保存;對(duì)于Nitrospira，選用NSR 1113f和NSR 1264r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸15 min，冷卻至4 ℃保存.
每種引物對(duì)的前端引物附40 bp的GC夾，便于后續(xù)的變性梯度凝膠電泳分析，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).
2.4.3 DGGE分析
將4 μL PCR樣品和1.5 μL 6倍加樣緩沖液混合，采用Bio-rad突變檢測(cè)系統(tǒng)，用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為45%~75%，在110 V的電壓下60 ℃電泳6 h，用SYBR GREEN I染料對(duì)凝膠進(jìn)行染色，獲得DGGE指紋圖譜.
2.4.4 基因測(cè)序
用潔凈的手術(shù)刀切取DGGE圖譜中的目的條帶，利用聚丙烯酰胺DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收純化后的DNA用同樣的對(duì)應(yīng)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送英駿生物公司進(jìn)行測(cè)序.序列通過(guò)NCBI基因庫(kù)進(jìn)行在線BLAST比對(duì)分析.
2.4.5 相似性和多樣性分析(Analyse)
通過(guò)比較相似性系數(shù)來(lái)分析樣品圖譜的相似性.試驗(yàn)所得圖像用BIO-RAD的Quantity One軟件分析.微生物多樣性指數(shù)采用Shannon指數(shù)表示，公式為：H=-∑PilgPi，其中，Pi=ni/N，ni為峰面積，N為所有峰的總面積.
3 結(jié)果討論
3.1 不同DO條件下A/O系統(tǒng)的脫氮效果和污泥性質(zhì)
3.1.1 不同DO條件下A/O系統(tǒng)(system)的脫氮效果
圖 2和圖 3分別顯示了在不同DO條件下A/O小試系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)出水的氮素濃度和去除率.硝化過(guò)程是耗氧反應(yīng)，當(dāng)小試系統(tǒng)曝氣池中的DO濃度維持在3 mg?L-1和2 mg?L-1時(shí)，系統(tǒng)在很短的時(shí)間內(nèi)就能實(shí)現(xiàn)很好的硝化效果，當(dāng)改變曝氣池中的溶解氧濃度，系統(tǒng)在幾天之內(nèi)氨氮的去除率即可穩(wěn)定.當(dāng)把系統(tǒng)曝氣池中的DO調(diào)至1 mg?L-1時(shí)，由于突然從高DO狀態(tài)調(diào)節(jié)至低DO狀態(tài)，運(yùn)行初始階段出水水質(zhì)存在波動(dòng)，但經(jīng)過(guò)2周左右的培養(yǎng)和馴化后出水氨氮和總氮均達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)，繼續(xù)降低曝氣池中的DO濃度，使其維持在0.5 mg?L-1時(shí)，出水氨氮和總氮并未出現(xiàn)較大的波動(dòng)，氨氮的平均去除率均為98%以上，總氮的平均去除率為85%以上.當(dāng)進(jìn)一步降低DO至0.3 mg?L-1時(shí)，盡管經(jīng)過(guò)30 d的連續(xù)運(yùn)行，氨氮的平均去除率下降到了95.4%，總氮的平均去除率為83.46%，整個(gè)過(guò)程出水水質(zhì)波動(dòng)較大，難以達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài). 然而，當(dāng)DO繼續(xù)降低到0.2 mg?L-1時(shí)，系統(tǒng)出現(xiàn)了大幅度波動(dòng)，出水氨氮和總氮濃度非常高，連續(xù)運(yùn)行了30 d后，出水水質(zhì)也未達(dá)標(biāo). 這些水質(zhì)結(jié)果表明該系統(tǒng)的運(yùn)行DO濃度只能降低到0.5 mg?L-1.
圖 2 A/O小試系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)出水的氮素濃度
圖 3 A/O小試系統(tǒng)內(nèi)氨氮和總氮的去除率
傳統(tǒng)生物脫氮過(guò)程的硝化反應(yīng)是在好氧條件下進(jìn)行的，氧氣作為電子受體，氮元素作為電子供體，將氨氮氧化為硝酸鹽氮.因此，為了能充分實(shí)現(xiàn)硝化反應(yīng)，污水處理廠往往將DO設(shè)計(jì)到2 mg?L-1以上. 根據(jù)本研究的結(jié)果，在DO為0.5 mg?L-1的情況下，系統(tǒng)也能很好地實(shí)現(xiàn)硝化作用，這樣可以大幅度節(jié)約硝化反應(yīng)所需要的能源.當(dāng)DO從0.5 mg?L-1繼續(xù)降低到0.3 mg?L-1甚至到0.2 mg?L-1，系統(tǒng)曝氣池中的硝化效果受到了較大的制約，這可能是因?yàn)樵诖薉O濃度下曝氣池中污泥易于沉降，泥水難以達(dá)到充分的混合.為了保證在此濃度下依然能達(dá)到較好的脫氮效果，可以在曝氣池中加裝攪拌器通過(guò)攪拌作用使泥水充分混合，但這會(huì)增加能量的消耗.另外，還可以通過(guò)增大污泥停留時(shí)間來(lái)補(bǔ)償?shù)虳O工況下由于氧氣不足所造成的脫氮效果下降. Liu等的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，他們考察了SRT為10 d和40 d兩種情況下，當(dāng)DO降低到0.2 mg?L-1以下時(shí)，在SRT為10 d的系統(tǒng)中硝化效果很難達(dá)到穩(wěn)定，而在SRT為40 d的系統(tǒng)中硝化效果較為穩(wěn)定.
3.1.2 不同DO條件下A/O系統(tǒng)(system)的MLSS和SVI的變化規(guī)律
隨著DO濃度的降低，活性污泥的MLSS和SVI均呈上升趨勢(shì). MLSS增加的幅度不是很大，DO為3、2、1、0.5和0.3 mg?L-1時(shí)，系統(tǒng)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)活性污泥的平均MLSS分別為3925、4155、4550、4910和5150 mg?L-1.總的來(lái)說(shuō)，MLSS隨著DO的降低而增加，這也與其它文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相一致. SVI也是隨著DO的降低而升高，系統(tǒng)內(nèi)的DO為3和2 mg?L-1時(shí)，活性污泥的SVI值在60~100 mL?g-1之間，活性污泥具有很好的沉降性能. DO為1 mg?L-1的工況下，活性污泥的SVI值在100~120 mL?g-1之間，沉降和凝聚性能依然很強(qiáng).DO為0.5 mg?L-1時(shí)，活性污泥的SVI值在140~160 mL?g-1之間，也屬于較正常的范圍. 但當(dāng)DO濃度降低到0.3 mg?L-1運(yùn)行時(shí)，系統(tǒng)中的活性污泥的SVI值在160~180 mL?g-1之間，處于膨脹(inflate)狀態(tài)，這也很好地證明了DO濃度為0.3 mg?L-1時(shí)，系統(tǒng)出水水質(zhì)很難穩(wěn)定達(dá)標(biāo)的結(jié)果.
3.2 硝化細(xì)菌群落分析
3.2.1 AOB群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化
5個(gè)不同DO工況下AOB的amoA功能基因DGGE圖譜如圖 4a所示.由圖可以看出，各個(gè)工況下的AOB菌群豐富度相對(duì)較單一，共檢測(cè)到8條優(yōu)勢(shì)條帶，分別標(biāo)記為1~
8. AOB的群落結(jié)構(gòu)隨著DO濃度的降低而發(fā)生了變化，在每個(gè)工況下都存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為條帶4和6所代表的細(xì)菌. 當(dāng)DO降低后，DO濃度為3 mg?L-1時(shí)存在的優(yōu)勢(shì)條帶7卻消失了，而且在DO濃度為0.5 mg?L-1時(shí)，出現(xiàn)了新的優(yōu)勢(shì)條帶5.
圖 4 不同DO條件下AOB的DGGE圖譜和所有條帶的檢測(cè)示意圖
圖 4b顯示，從高DO變化到低DO，系統(tǒng)內(nèi)AOB群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化率約為20%~40%，屬于中等程度的變化，高DO和低DO環(huán)境中AOB種群多樣性指數(shù)較為相似.在不同的DO環(huán)境下，A/O小試系統(tǒng)中AOB的多樣性均處于比較高的水平.DO為3 mg?L-1時(shí)小試A/O系統(tǒng)中AOB的多樣性最高，AOB的種群多樣性隨DO濃度的降低而減小，但減小的幅度很小，DO的降低并未對(duì)AOB的群落結(jié)構(gòu)造成太大的影響，系統(tǒng)中各種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分布的均勻性和穩(wěn)定性(The stability of)使得系統(tǒng)中AOB群落始終處于很穩(wěn)定的狀態(tài)，保證了系統(tǒng)氨氧化功能的穩(wěn)定性.
表 1 不同DO條件下各種硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)
圖 4a中標(biāo)有阿拉伯(Arab)數(shù)字的優(yōu)勢(shì)條帶的測(cè)序結(jié)果顯示，AOB均屬于Nitrosomonas，未檢測(cè)出有Nitrosospira，其中，條帶1、2、3和4屬于Nitrosomonas-like cluster，條帶 5屬于Nitrosomonas europaea，條帶6和7均為Nitrosomonas oligotropha所屬的細(xì)菌.條帶5和7均屬于低DO環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)AOB，由此說(shuō)明，所屬Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha 的AOB均可在低DO的環(huán)境中生存，特別是Nitrosomonas europaea所屬的AOB非常適合在0.5 mg?L-1的DO濃度下生存.這一結(jié)果也與其他研究者的結(jié)果相一致.
表 2 DGGE條帶的測(cè)序結(jié)果
3.2.2 NOB群落中Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)的變化
由圖 5a可知，Nitrobacter的群落結(jié)構(gòu)隨DO的降低發(fā)生了明顯的變化，高DO環(huán)境的Nitrobacter群落與低DO環(huán)境的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異，DO為1和0.5 mg?L-1工況下Nitrobacter的群落結(jié)構(gòu)最為相似，共同的優(yōu)勢(shì)種群為條帶Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7，Nb8則在DO為0.5 mg?L-1的環(huán)境下更為豐富（plump)，Nb18是DO為1 mg?L-1工況下存在的優(yōu)勢(shì)條帶.當(dāng)DO繼續(xù)降低至0.3 mg?L-1時(shí)，系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種群轉(zhuǎn)變?yōu)镹b4、Nb21、Nb22、Nb23，系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量明顯降低.
圖 5 不同DO條件下Nitrobacter的DGGE圖譜和所有條帶的檢測(cè)示意圖
圖 5b顯示，DO為1和0.5 mg?L-1工況下的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)最為相似，高DO和低DO環(huán)境下Nitrobacter的群落結(jié)構(gòu)相似性較低，不同DO環(huán)境中的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)差異較大，但1、0.5和0.3 mg?L-1工況下的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)相似性較高. Shannon-Weiner 指數(shù)顯示，不同DO環(huán)境下的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)差異較大，但每個(gè)DO工況下的優(yōu)勢(shì)（解釋:能壓倒對(duì)方的有利形勢(shì))種群數(shù)量均較高，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的均勻性也較高，因此，每個(gè)DO工況下的Nitrobacter群落均處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證了系統(tǒng)硝化功能的穩(wěn)定性.
測(cè)序結(jié)果顯示，系統(tǒng)中鑒定出的Nitrobacter可分為3類，分別為Group1 Nitrobacte
R、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter，其中，Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8、Nb9、Nb21、Nb22和Nb23屬于Group1 Nitrobacter，也是數(shù)量最多的一類Nitrobacter，Nb15、Nb16、Nb17、Nb18、Nb19和Nb20屬于Group2 Nitrobacter，Nb12、Nb13和Nb14屬于Group3 Nitrobacter.因此，結(jié)合圖 5b可以進(jìn)一步看出，系統(tǒng)DO從高濃度降低到低濃度時(shí)，系統(tǒng)中的Nitrobacter的種類從Group2和Group3轉(zhuǎn)變成了Group1.另外，從測(cè)序結(jié)果也可以看出，N. winogradskyi系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)Nitrobacter，但在高低DO工況下，它們屬于不同的發(fā)育分支.
3.2.3 NOB群落中Nitrospira群落結(jié)構(gòu)的變化
由圖 6a可知，不同DO條件下的Nitrospira群落結(jié)構(gòu)變化較小，系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌始終為Np3和Np4，相比于有著豐富群落結(jié)構(gòu)的Nitrobacter，系統(tǒng)中Nitrospira的優(yōu)勢(shì)種群較少.
圖 6 不同DO條件下Nitrospira的DGGE圖譜和所有條帶的檢測(cè)示意圖
圖 6b顯示了Nitrospira的DGGE圖譜的條帶分布、強(qiáng)度及每個(gè)工況的DGGE圖譜各樣品間的相似性.總體而言，不同DO條件下小試A/O系統(tǒng)(system)曝氣池中的Nitrospira種群相似性比較高，種群結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生較大的改變. 高DO和低DO環(huán)境下Nitrospira的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，從高DO變化到低DO，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化率約為10%~40%，變化程度較小.因此，DO的變化并未對(duì)Nitrospira的種群結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生較大的影響，不同DO環(huán)境中的Nitrospira群落結(jié)構(gòu)相類似. Shannon-Weiner 指數(shù)顯示，高DO下的Nitrospira多樣性相對(duì)較低，而在0.5 mg?L-1的系統(tǒng)中，兩種Nitrospira均為優(yōu)勢(shì)菌，其均勻度較高，因此，相應(yīng)的多樣性指數(shù)較高.
測(cè)序結(jié)果顯示，系統(tǒng)中鑒定出的Nitrospira均屬于Group1 Nitrospira，系統(tǒng)中并未檢測(cè)出Group2 Nitrospira中的細(xì)菌，Np1、Np2、Np3、Np4所代表的細(xì)菌均屬于同一類細(xì)菌，而且同源性很高，由此也說(shuō)明，小試A/O系統(tǒng)中Nitrospira的種類較單一，相比于Nitrobacter豐富的種群，Nitrospira的種類較少. 這也與類似的研究結(jié)果相一致.
由Nitrobacter和Nitrospira的多樣性指數(shù)可以看出，小試A/O系統(tǒng)中最主要的NOB為Nitrobacter.雖然Liu等的研究結(jié)果表明，在長(zhǎng)期的低DO環(huán)境下，Nitrospira-like比Nitrobacter-like的NOB數(shù)量更多，但Nitrobacter和Nitrospira具有不同的生存策略，Nitrospira遵循的是K策略，更適應(yīng)于在低濃度的亞硝酸鹽環(huán)境中生存，Nitrobacter的生長(zhǎng)實(shí)行的是r策略，在亞硝酸鹽濃度很低的環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)Nitrospira，但當(dāng)有足夠的亞硝酸鹽存在時(shí)，Nitrobacter的生長(zhǎng)速度比Nitrospira更快. 在缺少亞硝酸鹽的環(huán)境中，Nitrospira的含量更豐富，而在本研究的A/O系統(tǒng)中亞硝酸鹽并不是NOB生長(zhǎng)的限制因子，因此，Nitrobacter是小試A/O系統(tǒng)中最主要的NOB，主要貢獻(xiàn)了亞硝酸鹽的氧(Oxygen)化作用.具體參見污水寶商城資料或
4 結(jié)論
1)當(dāng)DO濃度從3 mg?L-1降低（reduce)到0.5 mg?L-1時(shí)，本研究中的推流式A/O小試系統(tǒng)仍然能保持很好的脫氮效果，氨氮和總氮的去除率分別達(dá)到了98%和85%以上;當(dāng)DO進(jìn)一步降低到0.3和0.2 mg?L-1時(shí)，出水水質(zhì)指標(biāo)不能達(dá)標(biāo)，系統(tǒng)運(yùn)行難以達(dá)到穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒有變動(dòng))狀態(tài).
2)PCR-DGGE的解析結(jié)果表明，A/O小試系統(tǒng)中AOB群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化水平約為20%~40%，Nitrospira群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化水平約為10%~40%，AOB和Nitrospira的群落結(jié)構(gòu)隨DO的變化并不顯著. 而Nitrobacter的群落結(jié)構(gòu)隨DO的降低發(fā)生了明顯的變化，不同DO環(huán)境中的Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)存在較大差異.
3)測(cè)序結(jié)果表明，A/O小試系統(tǒng)活性污泥中的優(yōu)勢(shì)AOB主要為Nitrosomonas oligotroph
A、Nitrosomonas-like和Nitrosomonas europaea，Nitrosomonas oligotropha的AOB更適宜在低DO的環(huán)境中生存. 系統(tǒng)中的Nitrobacter包括Group1 Nitrobacte
R、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter 3類中的細(xì)菌，其中，Group1 Nitrobacter是最多的一類Nitrobacter，也是適應(yīng)在低DO環(huán)境下生存的Nitrobacter.小試A/O系統(tǒng)中Nitrospira主要的優(yōu)勢(shì)菌種始終是Group 1 Nitrospira.
