剩余污泥厭氧(Oxygen)消化的效率在很大程度上取決于厭氧微生物種群多樣性及優(yōu)勢(shì)種群的活性[10,11].不同條件下厭氧消化運(yùn)行的穩(wěn)定性及效率與系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的變遷會(huì)存在一定的關(guān)聯(lián).厭氧污泥中主要存在水解發(fā)酵菌、 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、 產(chǎn)甲烷菌及硫（化學(xué)符號(hào)：S）酸鹽還原菌[12].其中產(chǎn)甲烷菌屬于典型的古細(xì)菌，大致可以分為兩類：一類主要利用乙酸產(chǎn)生甲烷，主要有產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷髦毛菌; 另一類利用氫和二氧化碳合成甲烷.由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、 鑒定的局限性，近年來(lái)研究人員嘗試應(yīng)用基于16S rRNA的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)厭氧污泥系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析.其中末端限制性片段多態(tài)性根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片斷的大小不同以及標(biāo)記片斷種類和數(shù)量的不同來(lái)分析群落的結(jié)構(gòu)及組成. Collins等[13]利用T-RFLP技術(shù)對(duì)接種污泥和接種后的污泥中微生物菌群變化進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)接種污泥中占優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)甲烷菌群是Methanosarcinale
S、 Methanobacteria和Proteobacteria，而反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定后占優(yōu)勢(shì)的菌群為Methanosarcina vacuolata和Methanobacterium palustre.T-RFLP技術(shù)可以很靈敏地檢測(cè)微生物種類的微小變化，能夠提供微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量動(dòng)態(tài)變化的信息，已成功應(yīng)用于厭氧污泥產(chǎn)CH4菌的群落結(jié)構(gòu)、 動(dòng)態(tài)變化的檢測(cè)等方面[14].
本研究采用剩余污泥厭氧消化產(chǎn)CH4生成勢(shì)的測(cè)試方法[15, 16]，對(duì)兩廠的剩余污泥厭氧消化進(jìn)行了批次實(shí)驗(yàn)，在兩廠剩余污泥的產(chǎn)的產(chǎn)CH4速率、 基質(zhì)濃度回歸的基礎(chǔ)上得出產(chǎn)CH4的關(guān)鍵參數(shù)，評(píng)價(jià)不同剩余污泥在厭氧消化過(guò)程中的產(chǎn)CH4生成勢(shì); 同時(shí)對(duì)BMP實(shí)驗(yàn)前后的水質(zhì)變化進(jìn)行分析，結(jié)合厭氧消化前后T-RFLP的變化，對(duì)兩種剩余污泥在厭氧消化過(guò)程中CH4生成勢(shì)的差異進(jìn)行解析[17].一方面可對(duì)不同剩余污泥厭氧消化過(guò)程中的產(chǎn)CH4潛能(Potential)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)也能為厭氧消化工藝中微生物菌群動(dòng)態(tài)變化跟蹤及關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化提供依據(jù).
1 材料與方法
1.1 厭氧污泥來(lái)源與特征
本研究所用的剩余污泥、 厭氧污泥分別來(lái)自于AP和DH污水處理廠，AP污水處理廠采用合流制明渠排水溝進(jìn)水，進(jìn)水水質(zhì)易受降雨影響，且泥沙等無(wú)機(jī)顆粒含量較高; DH污水處理廠配套管網(wǎng)設(shè)施完善，進(jìn)水為完整的下水管網(wǎng)收集的城市生活污水.污水廠長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，AP厭氧污泥的VSS/TSS值多在0.5以下，而DH厭氧污泥的VSS/TSS值維持在0.6以上，厭氧消化池代謝活性較好.AP剩余污泥的VSS為8 050 mg ?L-1，TSS為14 350 mg ?L-1.DH剩余污泥的VSS為9 250 mg ?L-1，TSS為13 230 mg ?L-
1. 1.2 BMP實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
AP-BM
P、 DH-BMP共設(shè)置6組不同的污泥負(fù)荷F/M進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由于污泥濃縮的不均衡性，實(shí)測(cè)F/M如表1所示.BMP實(shí)驗(yàn)在120 mL的血清瓶中進(jìn)行，依據(jù)測(cè)試基質(zhì)濃度加入定量剩余污泥.采用Owen等[15]提出的厭氧微量元素溶液配方，其中CaCl2 ?2H2
O、 NH4C
L、 MgCl2 ?6H2
O、 KC
L、 MnCl2 ?4H2
O、 CoCl2 ?6H2
O、 H3BO3、 CuCl2 ?2H2
O、 Na2MoO4 ?2H2
O、 ZnCl2的濃度分別為16.7、 26.6、 120、 86.7、 1.33、
2、 0.38、 0.18、 0.17、 0.14 g ?L-1.每個(gè)血清瓶加入27 mL的微量元素液體和5.4 mL的2HPO4，之后依據(jù)不同的F/M比值接種厭氧污泥、 剩余污泥后，蓋上膠蓋并用鋁箔封口.在35℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程(guò chéng)中以玻璃注射筒測(cè)量總產(chǎn)氣量，并利用GC-ECD測(cè)定CH4、 CO2和H2的比例.共設(shè)置兩組平行實(shí)驗(yàn)，取均值進(jìn)行產(chǎn)氣量、 水質(zhì)分析. AP-BM
P、 DH-BMP分別設(shè)置兩組平行實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)氣量測(cè)量可精確到0.1 mL.
表 1 BMP實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)F/M比
1.3 分析方法
1.3.1 常規(guī)指標(biāo)
常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)，包括p
H、 TS
S、 NH+4-
N、 TK
N、 COD等，均依照美國(guó)EPA規(guī)定的Standard Methods[18]規(guī)定進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中氣體成分的測(cè)量采用氣相色譜進(jìn)行.
1.3.2 T-RFLP分析
圖1 實(shí)測(cè)CH4累積產(chǎn)氣量與回歸曲線
本研究參照了Lueders等[19]建立的T-RFLP方法對(duì)實(shí)驗(yàn)前后厭氧污泥的生物多樣性進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)步驟如下：
①通過(guò)PCR來(lái)復(fù)制DNA樣品中的目標(biāo)基因，引物為在5′的尾端上帶有熒光的Ar 109f和Ar 912r*，首先在94℃預(yù)變性5 min，擴(kuò)增循環(huán)階段包括94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共循環(huán)28 cycles，最后在72℃條件下延伸6 min.
?、谠?.5 μL的PCR產(chǎn)物中加入0.5 μL TaqⅠ和1.5 μL的緩沖溶液，在65℃條件下消化切割2 h;
?、蹖⑶懈詈蟮钠卫秒娪痉蛛x并以熒光偵測(cè)器檢測(cè)片段上所帶的熒光強(qiáng)度. Lueders等[19]成功分離、 克隆出產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiacea
E、 RC-I和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriaceae，未能定性的菌種歸入Diverse類.
1.3.3 數(shù)據(jù)分析
剩余污泥厭氧消化過(guò)過(guò)程中累積CH4產(chǎn)氣量采用改進(jìn)的Gompertz模型回歸分析(Analyse)[20]
式中，y為累積產(chǎn)氣量; δ為產(chǎn)氣末期校正斜率; t為反應(yīng)時(shí)間; A為平衡產(chǎn)氣量; Rmax：最大產(chǎn)氣速率; λ：遲滯期. 底物的厭氧代謝過(guò)程實(shí)質(zhì)上是一系列的酶促反應(yīng)，因此采用Michaelis-Menten模型描述（description）剩余污泥濃度與比產(chǎn)氣速率的關(guān)系： V=Vmax ? S Km+S 式中，Vmax為最大比產(chǎn)氣速率[mL ?-1]; V為比產(chǎn)氣速率[mL ?-1]; Km為半飽和常數(shù); S為基質(zhì)濃度.
2 結(jié)果與討論
2.1 BMP產(chǎn)氣結(jié)果分析
AP-BM
P、 DH-BMP批次實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間分別為439
H、 765 h，6組不同的投配比設(shè)計(jì)累積產(chǎn)氣量存在著明顯的差異.實(shí)驗(yàn)初期累積產(chǎn)氣量差異不明顯，后期逐步增大.兩組實(shí)驗(yàn)氣體成分均以CH4、 CO2為主，同時(shí)存在少量的H2.實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣均勻，可分為兩個(gè)階段.第一階段產(chǎn)氣速率大，產(chǎn)甲烷菌利用溶解性COD或易水解性物質(zhì)進(jìn)行厭氧發(fā)酵; 之后產(chǎn)氣速率逐漸降低（reduce)至穩(wěn)定水平，該階段的限速步驟為剩余污泥的水解過(guò)程，產(chǎn)氣隨著水解的進(jìn)程而穩(wěn)定增加.至該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每天仍有穩(wěn)定體積（volume)的氣體產(chǎn)生，表明微生物的水解、 厭氧產(chǎn)CH4仍在進(jìn)行中.應(yīng)用改進(jìn)的Gompertz模型對(duì)AP-BM
P、 DH-BMP產(chǎn)氣進(jìn)行回歸后的參數(shù)如表2所示.兩廠的厭氧污泥產(chǎn)氣數(shù)據(jù)與改進(jìn)的Gompertz模型擬合較好.通常厭氧消化過(guò)程中的限速步驟為水解破壁過(guò)程[21, 22]，在無(wú)添加外來(lái)基質(zhì)的0號(hào)樣品中，A
P、 DH厭氧污泥的遲滯期分別為20.00
H、 12.93 h，表明DH厭氧污泥的活性較高.
表2 改進(jìn)Gompertz模型回歸BMP實(shí)驗(yàn)（experiment)參數(shù)
圖2 Michaelis-Menten模型回歸BMP產(chǎn)CH4速率參數(shù)
采樣Michaelis-Menten模型對(duì)兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)濃度、 比產(chǎn)氣速率回歸后的結(jié)果如圖2所示.A
P、 DH厭氧污泥的最大比產(chǎn)氣速率差距不大，分別為74.21、 51.99 mL ?-1，但兩廠厭氧污泥的Km存在著顯著的差異，DH厭氧污泥的Km為19 005 mg ?L-1而AP厭氧污泥的Km高達(dá)54 098 mg ?L-1.Km是表征底物親和力的常數(shù)，表明AP厭氧污泥對(duì)該廠剩余污泥的適應(yīng)性差，需要在較高的基質(zhì)濃度下才能表現(xiàn)出較好的產(chǎn)CH4性能.
2.2 水質(zhì)變化分析
AP-BM
P、 DH-BMP兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不同F(xiàn)/M條件下的水質(zhì)狀況如下表3所示.兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)中隨著F/M增大，pH由弱酸性漸變?yōu)槿鯄A性，分別位于在6.8~7.2、 6.7~7.1范圍內(nèi).0號(hào)呈弱酸性，可能由未添加基質(zhì)，厭氧污泥自身的水解造成[23].DH-BMP與AP-BMP實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)ORP值分別位于-235~-280 mV與-235~-282 mV范圍內(nèi).隨著F/M比的增大，兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)的ORP值都呈下降的趨勢(shì).厭氧環(huán)境的主要標(biāo)志是發(fā)酵液具有低的ORP，不同的厭氧消化體系和不同的厭氧微生物對(duì)ORP的要求不同[24].
兩批次實(shí)驗(yàn)中在高F/M條件下下CODT下降明顯.與AP-BMP實(shí)驗(yàn)相比，DH-BMP實(shí)驗(yàn)結(jié)束后CODT下降更為顯著，5號(hào)樣品中由之前的47 000 mg ?L-1下降至32 480 mg ?L-1，在高F/M條件下厭氧消化進(jìn)行得更為完全.批次實(shí)驗(yàn)前后，NH+4-N濃度均有提高，不同F(xiàn)/M條件下NH+4-N變化差異較大，DH-BMP實(shí)驗(yàn)中5號(hào)樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)束后NH+4-N濃度達(dá)到了755.5 mg ?L-1.污泥厭氧消化過(guò)程中，污泥的水解是限速步驟（procedure).在高F/M條件下，厭氧污泥代謝旺盛，使得剩余污泥的破壁、 氨化過(guò)程進(jìn)行得較為完全，從而使得NH+4-N顯著提升[4].兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)前后TSS變化呈現(xiàn)出與CODT類似的趨勢(shì)，高F/M條件下下降趨勢(shì)明顯，DH-BMP實(shí)驗(yàn)中5號(hào)樣品的TSS由實(shí)驗(yàn)前的45 100 mg ?L-1下降至38 050 mg ?L-1.綜合比較AP-BMP與DH-BMP實(shí)驗(yàn)前后水質(zhì)變化，DH-BMP實(shí)驗(yàn)前后COD
T、 TSS下降趨勢(shì)更加明顯，表明DH-BMP過(guò)程中代謝活躍，厭氧消化過(guò)程進(jìn)行得較為完全.
表3 BMP實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诓煌現(xiàn)/M條件下主要水質(zhì)
圖3 A
P、 DH剩余污泥厭氧消化前后主要T-RFs豐度變化
2.3 厭氧污泥生物多樣性分析
圖3表示了以AP-BM
P、 DH-BMP實(shí)驗(yàn)前后產(chǎn)甲烷功能菌組成的變化情況.與AP-BM
P、 DH-BMP兩個(gè)批次實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)CH4、 水質(zhì)變化情況相一致，DH接種厭氧污泥中產(chǎn)甲烷菌群的相對(duì)含量高于AP接種厭氧污泥，AP-BMP中0號(hào)樣品的雜菌相對(duì)含量超過(guò)60%.DH厭氧污泥中產(chǎn)甲烷功能菌群豐富且相對(duì)含量較高，可能（maybe)是DH-BMP實(shí)驗(yàn)中半飽和常數(shù)Km顯著低于AP-BMP中回歸數(shù)值的重要原因.
AP-BMP實(shí)驗(yàn)（experiment)后，未添加基質(zhì)的0號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后雜菌相對(duì)含量降至14%，這可能（maybe)是由于基質(zhì)的缺乏，產(chǎn)甲烷菌將雜菌分解代謝造成.4號(hào)樣品中的雜菌含量也有所降低（reduce)但幅度不大.同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兩組的產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae和RC-I的相對(duì)含量皆有提高.DH-BMP實(shí)驗(yàn)前后產(chǎn)甲烷功能菌的組成變化情況與AP-BMP變化類似.DH-BMP實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)雜菌含量降低，0號(hào)、 5號(hào)樣品中雜菌相對(duì)含量不足17%.產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae 和RC-I的相對(duì)含量皆有所提高，表明產(chǎn)甲烷菌的活性和相對(duì)豐度在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得以提高.已有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.主要以乙酸為基質(zhì)生成甲烷[25]，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.相對(duì)含量提高，而其它兩種產(chǎn)甲烷菌以H2和CO2為基質(zhì)生成甲烷，由于兩組BMP實(shí)驗(yàn)中H2的生成量較低，因此產(chǎn)甲烷桿菌Methanobacteriacea 、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae相對(duì)含量變化不如產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.增加顯著[4].具體參見(jiàn)污水寶商城資料或
3 結(jié)論
A
P、 DH剩余污泥厭氧消化產(chǎn)CH4采用改進(jìn)Gompertz模型回歸的最大比產(chǎn)氣速率數(shù)值接近，分別達(dá)到了74.21 mL ?-1、 51.99 mL ?-1，但對(duì)基質(zhì)剩余污泥的半飽和常數(shù)Km差異較大，分別為54 098 mg ?L-1和19 005 mg ?L-1，表明AP剩余污泥親和性差、 難于厭氧消化.
BMP實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，TS
S、 CODT有所下降，NH+4-N顯著提高，且高污泥負(fù)荷F/M條件下水質(zhì)變化趨勢(shì)更為顯著.與AP-BMP實(shí)驗(yàn)相比，DH-BMP水質(zhì)變化顯著.
兩批次實(shí)驗(yàn)前后T-RFLP分析(Analyse)結(jié)果與其生化產(chǎn)CH4勢(shì)相一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后雜菌（fungus)相對(duì)含量顯著下降，產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌 Methanomicrobiaceae和RC-I的相對(duì)含量皆有所提高，且DH-BMP樣品中產(chǎn)甲烷功能菌群相對(duì)含量提升程度高于AP-BMP.
