完全混合式曝氣系統(tǒng)具有占地面積較小，投資和能耗較低，抗沖擊負荷能力較強的優(yōu)點，曝氣系統(tǒng)內(nèi)各點底物濃度，污泥濃度和需氧速率相同，為系統(tǒng)內(nèi)同步硝化反硝化發(fā)生提供了基礎.到目前為止對同步硝化反硝化作用機制存在不同認知：微環(huán)境理論認為物質(zhì)傳遞、菌膠團結構及各類微生物(Micro-Organism)分布和活動等致使菌膠團內(nèi)部形成多種多樣的微環(huán)境類型，為同步硝化反硝化的存在創(chuàng)造可能;而從生物學角度闡釋同步硝化反硝化機制則始于對好氧反硝化菌株Thiosphaera pantotropha的研究，好氧反硝化菌細胞內(nèi)存在不受DO抑制的反硝化酶系統(tǒng)，其好氧反硝化能力與胞內(nèi)特殊硝酸鹽還原酶--周質(zhì)硝酸鹽還原酶表達密切相關，Huang等對具有好氧反硝化功能的菌株DNA進行周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA擴增，得到了明顯的DNA特異條帶，證明了好氧反硝化菌可以表達周質(zhì)硝酸鹽還原酶.但目前基于完全混合式曝氣系統(tǒng)同步硝化反硝化的形成條件和污泥微生物菌種結構解析的研究還相對較少，從而限制了完全混合式曝氣系統(tǒng)的發(fā)展與應用.
因此，本文以無錫市某污水處理(chǔ lǐ)廠100 t?d-1完全混合式曝氣系統(tǒng)的運行為出發(fā)點，通過進出水水質(zhì)分析，研究系統(tǒng)對污染物的去除效能;結合反硝化速率靜態(tài)試驗，闡明(clarify)系統(tǒng)污泥在好氧條件下的反硝化脫氮能力;通過周質(zhì)硝酸鹽還原酶PCR擴增和高通量測序技術，對系統(tǒng)污泥微生物菌群結構和多樣性進行解析，并確定系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌群，以期為完全混合式曝氣系統(tǒng)的反硝化脫氮應用提供理論依據(jù)和技術支撐.
1 材料與方法1.1 完全混合式曝氣系統(tǒng)運行
完全混合式曝氣系統(tǒng)在無錫某城鎮(zhèn)污水處理廠運行，系統(tǒng)為鋼板池體，長約為10
M、寬為1.5
M、高為3.5 m，設計處理能力為100 t?d-1，工藝流程如圖 1所示.原水通過進水泵進入生化罐，然后依次流經(jīng)生化池1、生化池2和生化池3，生化罐及各生化池底部均布置穿孔管曝氣，最后進入過濾沉淀池進行泥水分離，處理后出水外排.系統(tǒng)包括(bāo kuò)兩套回流系統(tǒng)，分別維持生化罐和生化池內(nèi)的污泥濃度.系統(tǒng)自2011年啟動運行，效果穩(wěn)定，2015年春節(jié)前停止運行，春節(jié)后再次啟動，運行參數(shù)(parameter)如下：進水流量為3 m3?h-1，HRT為10~12 h，SRT大于30 d，反應器內(nèi)污泥濃度為7~10 g?L-1，回流比Q1為150~200%，Q2為200%，DO設定為1~3 mg?L-1，濾料反沖洗頻率為8 h.污泥來源于污水處理廠好氧池.
1.2 進水水質(zhì)
完全混合式曝氣系統(tǒng)進水取自污水處理廠提升泵房之前深度約4.5 m左右的污水，水質(zhì)如表 1所示.
表 1 污水處理廠進水水質(zhì)/mg?L-1
1.3 試驗方法1.3.1 污染物指標測定
CO
D、NH4+-
N、T
N、NO2--N和NO3--N通過標準方法進行測定;D
O、pH采用Multi3410型溶氧儀測定.
1.3.2 反硝化模擬試驗
為了驗證完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在不同DO梯度下的反硝化活性差異，對系統(tǒng)污泥進行反硝化模擬試驗.共設置3組試驗，控制溫度為20℃，初始硝態(tài)氮濃度45 mg?L-1，以無水乙酸鈉為碳源，按C/N=7投加，采用微曝氣供氧，反應過程DO濃度分別控制為0.1~0.2、1.0~2.0和2.0~3.0 mg?L-1，污泥濃度均控制為4 000 mg?L-1左右.分別在反應第0、
30、60、90、120、150、180、210和240 min取樣，將取出的混合液過濾后測定其硝酸鹽濃度.最后根據(jù)不同時刻硝酸鹽濃度變化與測定混合液中MLVSS的值，計算反硝化速率.
1.3.3 同步硝化反硝化能力測定
完全混合式曝氣系統(tǒng)的同步硝化反硝化能力可以通過計算同步硝化反硝化率[式]和同步硝化反硝化速率[式]得到：
式中，Efficiency為同步硝化反硝化率;R為同步硝化反硝化速率mg?-1;NH4+為NH4+-N的消耗量;NOx-為NO3--N和NO2--N的生成量;t為運行時間.
1.3.4 總DNA提取及測序
取適量系統(tǒng)污泥樣品放入2 mL離心管內(nèi)，充分振蕩30 s，在10 000 r?min-1條件下離心1 min，棄去上清液.樣品經(jīng)預處理后采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取污泥樣品中微生物總宏基因組，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，最后置于-20℃下保存?zhèn)溆?測序工作由晶能生物技術有限公司完成，測序儀器為Illumina MiSeq，采用Trimmomatic軟件對序列進行去雜，采用Qiime軟件進行群落豐度計算.
1.3.5 周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因的PCR擴增
由于污泥長期在完全混合式曝氣系統(tǒng)中馴化，因此對系統(tǒng)污泥中是否存在好氧反硝化菌進行鑒定.采用周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因保守區(qū)的一部分序列為引物，引物NAP1和NAP2，擴增產(chǎn)物長度為877bp. PCR反應體系：10×buffer 4 μL，dNTP2 μL，引物NAP1和引物NAP2各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.8 μL，重蒸水38.2 μL. PCR程序如下：94℃變性5 min;然后進行30個循環(huán)：94℃，30 s;59℃，30 s;72℃，60 s;最后72℃延伸7 min. PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證.
2 結果與討論2.1 COD去除效果
完全混合式曝氣系統(tǒng)對沖擊負荷表現(xiàn)出較好的抵抗能力，系統(tǒng)穩(wěn)定運行后，盡管進水COD濃度波動較大，但出水COD較穩(wěn)定，基本維持在7.8~35.3 mg?L-1，平均值為17.1 mg?L-1，優(yōu)于GB 18918-2002的一級A排放標準，COD篩除率為82.4%~98.3%，平均去除率為93.2%.結果表明維持系統(tǒng)較高的污泥濃度可以保證生物降解的穩(wěn)定性，使整個工藝對COD的去除保持在較高水平.
圖 2顯示了系統(tǒng)沿程COD變化趨勢.原水COD濃度約346 mg?L-1，進入系統(tǒng)后迅速下降，經(jīng)過回流稀釋作用及曝氣條件下異養(yǎng)菌對碳源的消耗（consume)，生化罐中混合液COD濃度已降至86 mg?L-1，系統(tǒng)出水COD濃度約為20 mg?L-1.由此可見，完全混合式曝氣系統(tǒng)具有較強的COD去除能力，其原因在于：
① 系統(tǒng)采用完全混合曝氣的模式，強化了異養(yǎng)菌對有機物的降解與消耗;
② 系統(tǒng)具有較大的回流，延長了污水實際水力停留時間，從而強化了系統(tǒng)對有機感染物的去除能力.完全混合式曝氣系統(tǒng)可以為包括好氧(Oxygen)反硝化菌在內(nèi)的異養(yǎng)微生物提供適宜的生長環(huán)境，而大部分好氧反硝化菌同時具有異氧硝化及代謝降解有機物的能力，可以在曝氣條件下表現(xiàn)出對有機底物較高的去除能力.
圖 2 進出水COD濃度及沿程變化特征
2.2 氮去除效果
完全混合式曝氣系統(tǒng)進出水NH4+-
N、TN變化曲線如圖 3所示.系統(tǒng)進水NH4+-N為1.33~57.1 mg?L-1，均值為30.3 mg?L-1，出水NH4+-N為0.2~5.6 mg?L-1，均值為0.89 mg?L-1，平均去除率達96.9%，出水NH4+-N超標率低于2%.系統(tǒng)進水TN波動較大，在7.7~58.3 mg?L-1之間，均值為33.6 mg?L-1，出水TN在1.9~26.9 mg?L-1范圍波動，平均去除率為75.2%，均值為7.8 mg?L-1，出水氨氮和TN均優(yōu)于GB 18918-2002的一級A排放標準，表明系統(tǒng)具有較強的脫氮能力.當系統(tǒng)運行至第70 d左右時，出水TN濃度高于20 mg?L-1，這是由于濾池內(nèi)濾料出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，增加系統(tǒng)反沖洗頻率后使反沖洗過程中部分污泥顆粒隨出水流出，導致系統(tǒng)TN升高.但在恢復反沖洗頻率后，出水水質(zhì)得以改善.
圖 3 進出水NH4+-N和TN濃度的變化
為了考察完全混合式曝氣系統(tǒng)各單元對氮轉化的作用和貢獻，對其各單元出水中氮組分及濃度進行測定，結果如圖 4所示.根據(jù)式和計算得生化罐的同步硝化反硝化率為99.6%，同步硝化反硝化速率為32.9 mg?-1，生化罐中具有良好的同步硝化反硝化能力，氨氮進入生化池1后持續(xù)降低，最終出水氨氮低于1 mg?L-1.生化池1的同步硝化反硝化率為94%，同步硝化反硝化速率為1.1 mg?-1.由圖 4中總氮，硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮的變化可知，系統(tǒng)同時具備較強的反硝化脫氮能力，而且不存在亞硝酸鹽的積累現(xiàn)象.系統(tǒng)僅在單一曝氣條件下就能實現(xiàn)同步硝化反硝化，有效節(jié)省了占地面積并在系統(tǒng)堿度維持方面更具有經(jīng)濟性.
圖 4 不同形態(tài)氮濃度的沿程變化
為進一步研究系統(tǒng)各反應單元的實際運行狀態(tài)，對每個反應單元的DO進行24 h連續(xù)監(jiān)測，結果如表 2所示.生化罐和生化池1內(nèi)溶解氧較低，其DO均低于0.5 mg?L-1，生化池2和生化池3的DO濃度較高，一般維持在1~4 mg?L-1.其原因在于進水有機物濃度較高，異養(yǎng)菌在曝氣條件下快速降解有機物并消耗大量溶解氧，導致(cause)在系統(tǒng)前段溶解氧明顯低于設定值.隨著有機物的消耗，系統(tǒng)后段的DO濃度逐漸上升.通過核算發(fā)現(xiàn)生化罐和生化池1中硝酸鹽濃度分別降低（reduce)1.82 mg?L-1和1.67 mg?L-1，而在生化池2和生化池3中硝酸鹽濃度略有上升，但總氮呈降低趨勢（trend)，系統(tǒng)中可能存在好氧反硝化菌群.研究表明不同菌屬的好氧反硝化菌對DO的耐受能力存在顯著差異，大部分好氧反硝化菌在DO濃度低于3 mg?L-1時仍具有較高的反硝化活性.根據(jù)系統(tǒng)氮平衡分析，生化罐和生化池1中的同步硝化反硝化現(xiàn)象明顯強于生化池2和生化池3，其原因可能基于以下兩方面：第一，系統(tǒng)前段C/N明顯高于后段，較高的C/N能保證充足的碳源，進而有利于反硝化反應順利進行，Ahmad也在研究中發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌的反硝化活性同樣隨著C/N的升高而增大;第二，較低的DO濃度有利于活性污泥絮體內(nèi)部形成缺氧微環(huán)境，從而使缺氧反硝化與好氧反硝化相協(xié)同，進一步強化同步硝化反硝化效果.
表 2 系統(tǒng)DO分布/mg?L-1
2.3 反硝化特性
反硝化模擬試驗的硝態(tài)氮濃度隨時間變化曲線如圖 5所示，在DO濃度為0.1~0.2 mg?L-1時，完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在最初的2 h內(nèi)硝酸鹽還原效果明顯，其脫氮速率為4.09 mg?-1.當DO濃度在1.0~2.0 mg?L-1和2.0~3.0 mg?L-1時，污泥脫氮速率分別為0.73和0.67 mg?-1，系統(tǒng)污泥在低DO濃度條件下的脫氮能力約為高DO濃度條件下的5.8倍.這是因為系統(tǒng)污泥中的反硝化菌群適應低DO條件，從而表現(xiàn)出更高的活性;同時，DO會優(yōu)先于NO3--N被異養(yǎng)微生物利用，且相對較高DO濃度會有利于異養(yǎng)菌消耗有機物，從而使反硝化菌群在高DO條件下的反硝化能力受到抑制[22].當DO較高時，系統(tǒng)污泥仍具有較好的反硝化效果，表明系統(tǒng)中可能存在好氧反硝化菌群.
圖 5 不同DO條件下污泥反硝化效果
取污水處理(chǔ lǐ)廠污泥與系統(tǒng)污泥反硝化能力進行對比發(fā)現(xiàn)，當控制DO濃度為0.1~0.2 mg?L-1時，兩座污水處理廠缺氧池污泥反硝化能力明顯受到抑制，其脫氮速率僅為0.58和1.43 mg?-1，反硝化能力明顯低于完全混合式曝氣系統(tǒng)污泥.
完全混合式曝氣系統(tǒng)一般運行約30 d即可實現(xiàn)對CO
D、氨氮和總氮的穩(wěn)定高效（指效能高的）去除，隨著進水沖擊負荷的變化，污染物去除效果穩(wěn)定.系統(tǒng)運行過程中極少出現(xiàn)污泥上浮與污泥膨脹等不利現(xiàn)象，適用性比較高.
2.4 微生物特性
由圖 6可知，完全混合式曝氣系統(tǒng)在有氧條件下的反硝化能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)活性污泥，因此對活性污泥進行周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因的PCR擴增.
圖 6 系統(tǒng)(system)污泥與傳統(tǒng)活性污泥在低DO條件下的反硝化效果
試驗結果如圖 7所示，編號1、2和3為系統(tǒng)春季運行時污泥樣品;4和5為污水處理廠A缺氧池污泥樣品;6和7為污水處理廠B缺氧池污泥樣品;8和9為系統(tǒng)秋季運行時污泥樣品.系統(tǒng)污泥得到明顯清晰的877 bp的DNA特異條帶，表明系統(tǒng)污泥存在周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA，可以表達周質(zhì)硝酸鹽還原酶，污泥中含有典型的好氧反硝化細菌，其在好氧條件下經(jīng)由周質(zhì)硝酸鹽還原酶的催化還原硝酸鹽，產(chǎn)生氮氣實現(xiàn)好氧反硝化，提高系統(tǒng)的總氮去除能力.污水處理廠A中活性污泥顯示存在特異性條帶，表明污水處理廠A中存在少量好氧反硝化菌，但是其強度較低，未在反硝化微生物中占優(yōu)勢，無法顯著增強污水處理廠A的總氮去除效果，而污水處理廠B幾乎不存在好氧反硝化菌.
圖 7 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖像
為準確反映完全混合式曝氣系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落結構，對系統(tǒng)穩(wěn)定運行的不同時期的微生物群落結構進行解析.通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)污泥中微生物共有42個綱，污泥微生物比例分布如圖 8所示.不同時期系統(tǒng)污泥微生物菌群結構基本一致，以變形菌綱為主，其中β變形菌綱、γ變形菌綱、δ變形菌綱和α變形菌綱比例分別占變形菌綱54.45%、10.60%、7.80%和7.85%;鞘脂桿菌綱占6.02%，厭氧(Oxygen)繩菌綱占2.71%，放線菌綱占1.66%，酸桿菌綱占1.03%.其中β變形菌綱與污水處理(chǔ lǐ)過程密切相關，是污水處理廠脫氮的重要菌群，可以在低溶解氧條件下利用有機物生長繁殖.測序結果表明，系統(tǒng)污泥微生物中動膠菌屬，陶厄氏菌屬和Dechloromonas菌屬始終處于優(yōu)勢地位，其中Zoogloea屬與菌膠團的形成有密切關系，可能會促進系統(tǒng)實現(xiàn)同步硝化反硝化作用;Thauera屬是β變形菌中的一類革蘭氏陰性細菌，大部分為桿狀且以反硝化菌居多，如T. aromatic
A、T.mechernichensis和T. terpenica等，而其中T. mechernichensis是一類典型的好氧反硝化菌;Dechloromonas菌屬具有良好的反硝化功能，主要功能菌D. agitate和D. denitrificans都具有較強的氨氮水(Nitric acid)鹽還原能力[23].隨著季節(jié)的變化，僅Azohydromonas和Longilinea菌屬存在較大波動，但污泥微生物群落結構整體變化較小，使完全混合式曝氣系統(tǒng)始終保持良好的脫氮效能.完全混合式曝氣系統(tǒng)內(nèi)污泥微生物多樣性豐富，為系統(tǒng)的高效脫氮奠定了基礎.具體參見污水寶商城資料或
圖 8 系統(tǒng)中污泥微生物綱的分布比例
表 3 系統(tǒng)污泥微生物優(yōu)勢菌屬及其比例/%
3 結論
采用完全混合曝氣系統(tǒng)處理污水，在無外加碳源的情況下，取得較好的有機物去除效果和脫氮效果，CO
D、NH4+-N和TN的去除率分別為93.2%、96.9%、75.2%，出水CO
D、NH4+-N和TN均優(yōu)于一級A排放標準.
完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在低DO濃度條件下具有較高的反硝化能力，其脫氮速率是污水處理廠污泥的2.86倍以上.當DO濃度大于1 mg?L-1時，系統(tǒng)污泥仍具有一定反硝化能力，其脫氮速率與污水處理廠污泥相當.
周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA的PCR擴增結果表明，系統(tǒng)內(nèi)存在一定濃度的好氧反硝化菌.系統(tǒng)內(nèi)污泥微生物結構穩(wěn)定，以變形菌綱為主，動膠菌屬，陶厄氏菌屬和Dechloromonas菌屬為優(yōu)勢菌屬.
